农业部指定非洲猪瘟试剂盒

农业部指定非洲猪瘟试剂盒使用说明书

（快提核酸扩增试剂盒）

【产品名称】

通用名称：农业部指定非洲猪瘟试剂盒（PCR荧光探针法） 英文名称：Diagnostic Kit for African Swine Fever Virus （PCR Fluorescence Probing）

［预期用途］

本试剂盒主要用于检测疑似感染猪抗凝血及临床病料中的非洲猪瘟病毒（ASFV,African Swine Fever Virus）核酸，适用于非洲猪瘟病毒的检测、辅助诊断和流行病学调查。

【试剂盒组分】

1、试剂盒组成及贮藏条件

2、需自备材料：生理盐水、无菌枪头、荧光PCR专用反应管、记号笔等。

【操作步骤】一、样品制备

1、血液样品：采集抗凝血（抗凝剂为EDTA）或血清样品，编号备用。

2、组织样品：采集脾脏、肝脏、淋巴结、扁桃体等病变组织样品或软蜱0.1g（黄豆粒大小），眼科剪剪碎于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，再加1mL生理盐水混匀，4°C条件下8000rpm/分钟离心2分钟，取上清液于灭菌离心管中，编号备用。

二、DNA提取

取反应液A 20μL分别加入到新的1.5mL离心管，加入抗凝而或血清或组织上清液2μL混匀，室温（20°C左右）静置3分钟，加入反应液B 20μL,吹打混匀即可，若为抗凝全血，则需8000rpm/分钟再离心2分钟后做为待检DNA溶液。

二、PCR扩增

1、配液：取出PCR反应液、酶混合液，在室温完全融化后，充分混匀，瞬离，可将酶混合液全部取岀直接加入到PCR反应液中，充分混匀，瞬离后按每份20μL分装使用；或按照每份PCR反应液17μL,酶混合液3μL的比例取一定的试验用量，混合两种反应液,瞬离后按照每份20μL分装到专用荧光PCR 反应管中，剩余试剂立即冻存；（操作过程要注意避光）

2、加样扩增：分别向上述PCR反应管中加入5μL样本 DNA或阴性对照或阳性对照，混匀并瞬离,放入荧光PCR仪上运行以下程序：

步骤 条件 循环数 UNG处理 50°C：2分钟1 预变性 95°C：3分钟1 预扩増 95°C：8秒55C：8秒5 PCR扩增 95°C：8秒55°C：8秒40

荧光通道选择FAM,在40循环阶段每个循坏的55°C时收集荧光信号。设置扩增体系为25μL,同时要选择 passive reference 和 quencher 为 none 的模式。

(注:若荧光PCR仪(如ABI7500)按说明书中的反应程序设置后因持温时间短无法运行,可将预扩增和PCR扩增条件变更为95°C：5秒55°C：30秒。)

【结果判定】1、基线和阈值设定；基线调整取6-15个循环的荧光信号，阈值设定以阈值线刚好超过阴性对照检测荧光曲线的最高点为原则。

2、质量控制：反应结束后，阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线，Ct值为＞38或无；阳性对照 的Ct值应≤30.0,且明显的扩增曲线；否则实验视为无效。

3、样品判定：待检样品荧光信号有指数型增加，且结果显示Ct值<35.0,报告为阳性；未检测到Ct 值或Ct值＞38或无明显扩增曲线，则样品判定为阴性。35≤Ct值≤8时，复检一次，重复结果为阳性者判定为阳性，否则判定为阴性。

【注意事项】1、实验前请仔细阅读本试剂盒说明书，严格按照操作步骤执行，在操作过程中对时间、试剂体积等精确控制可以获得最好的结果。

2、实验室应严格按照有关规定分区管理。各区间人员、器材、试剂及空气流向应有产格要求。

3、有关耗材确保洁净、无菌，核酸提取完成后尽快进入下一步试验或冷冻保存。

4、预混后的试剂应尽量在短期内使用完毕，户外使用应在加冰袋的泡沫盒保存，每日试验完毕应及时冷冻保存。

5、对于荧光PCR管要避免徒手或使用过的手套接触，检测过程中使用不带荧光物质一次性乳胶手套。

6、冻存试剂使用前应于室温下完全融化，充分混匀，瞬时离心使液体完全沉于管底。

7、样品、阴性对照封盖后，在通风环境添加阳性对照并及时封盖，避免组分间及气溶胶等假阳性污染。

8、扩增反应完毕后的PCR管严禁开盖,应和试验产生的其它废弃物一起及时收集,远离PCR实验室进行无害化处理。

【规格】50头份/盒。

【贮藏与有效期】-20°C以下避光保存，有效期12个月。

仅供兽医诊断使用